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日志

 
 

饲用植酸酶活性测定-分光光度法  

2010-04-20 11:51:58|  分类: 饲料品管及化验 |  标签: |举报 |字号 订阅

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1  范围

本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品,也使用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为90U/kg

 

2  植酸酶活性单位定义

样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37pH5.50的条件下,每分钟从植酸钠中释放1umol无机磷,即为一个植酸酶活性单位,以U表示。

 

3  方法原理

植酸酶在一定温度和pH条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性溶液中,用钒钼酸铵处理会生成黄色的[NH43PO4NH4VO3.16MoO3]复合物,在波长415nm下进行比色测定。

 

4  试剂和溶液

4.1  乙酸缓冲液(I,浓度(CH3COONa.3H2o)为0.25mol/L:称出23.816g三水乙酸钠于1000ml烧杯中,加入900ml水溶解,用冰乙酸(4.25ml/L)调节(酸度计)pH5.50±0.01,并用蒸馏水定用到1000ml溶量瓶中,室温下存放2个月有效。

4.2  乙酸缓冲液(,浓度为0.25mol/L:称出23.816g三水乙酸钠,0.5g曲拉通TritonX—100(化学纯),0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml烧杯中,加入900ml水溶解,用并醋酸(约4.25ml/L)调节至pH5.0±0.01,并用蒸馏水定容于1000ml容量瓶中,室温下放2个月有效。

4.3  植酸钠溶液(贮于冰箱4保存),浓度为7.5mmol/L:称出1.73225g肌醇六磷酸钠(植酸钠)于250ml容量瓶中,用乙酸缓冲液(4.1)溶解并定溶至刻度,冰乙酸(约0.675ml/L)调pH5.0,现用现配。

4.4  硝酸溶液1份硝酸+2份水溶液。

4.5  100g/L钼酸铵溶液:称出10g钼酸铵于100ml容量瓶中,加入1.0ml氨水(25%)用水溶解并定容至刻度(放置冰箱保存)。

4.6  2.35g/L偏钒酸铵溶液:称出0.235g钒酸铵于100ml棕色容量瓶中,放在60以下搅拌溶解后加入2ml硝酸溶液(4.4),用水溶解并定容至刻度。放冰箱保存,避光下保存一周有效。

4.7  颜色终止液:移取2份硝酸溶液(4.4),1份钼酸铵溶液(4.5),1份偏钒酸铵溶液(4.6)混和后使用,现用现配。

4.8  磷酸二氢钾:基准物。

4.9  植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)。

 

5 仪器和设备

5.1  实验室常用仪器和设备

5.2  恒温水浴锅:(37±0.1

5.3  分光光度计:有10个比色皿,可在415nm下测定吸光度。

5.4  磁力搅拌器

5.5  酸度计。精确至小数点后2位。

5.6  离心机:转速为4000r/min以上。

 

6  测定步骤(绝对法)

6.1  标准曲线

准确称出0.6804g105烘至恒重的基准磷酸二氢钾(4.8)于100ml容量瓶中,用乙酸缓冲液溶(4.2)解,并定容至100ml,浓度为50.0mmol/L(贮于冰箱4保存)。按表1的比例稀释成不同浓度,与试样一起反应测定,以吸光值为横坐标,反应体系中无机磷的含量(umol)为纵坐标。列出直线回归方程(y=ax+b)。

5个锥形瓶先依次加入0.5ml1.5mL3.5mL7.5mL15.5mL缓冲液再分别加入0.5mL浓度为50.0mmL的基准磷酸二氢钾溶液,摇匀。

1(用锥形瓶稀释):

标准序号

稀释量/ml

浓度/mmol/L

反应体系中无机磷的含量(umol

1

0.5→1

25

2.5

2

0.5→2

12.5

1.25

3

0.5→4

6.25

0.625

4

0.5→8

3.125

0.3125

5

0.5→16

1.5625

0.15625

18个试管每3个为一组。其中前15个(前五组)分别加入0.9mL缓冲液,(按表1中的标准序号 1对一组、2对二组、3对三组、4对四组、5对五组)各加入0.1ml锥形瓶中稀释液,再加入2ml植酸钠溶液(4.3);其余3个为一组做空白加入1.0mL缓冲液4.1),再加入2ml颜色终止液(4.7),摇匀。37水浴锅预热30min后,3个空白再加2mL植酸钠溶液,其它15个各加2ml颜色终止液,摇匀。

2   反应步骤及试剂、溶液用量见表如下:

反应顺序

样品、标准

样品空白(标准空白)

1、加乙酸缓冲液4.1

0.9mL

0.9ml

2、加入待反应液(4.8)

0.1mL

0.1mL

3、混合(摇匀)

4、依次加入底物(4.3

2mL(植酸钠)

2mL(终止液)

5、混合(摇匀)

637水解30min

7、依次加入终止液(4.7

2mL(终止液)

2mL(植酸钠)

8、混合(摇匀)

总体积

5mL

5mL

反映后的式样在室温下放置10min。如浑浊则离心(4000r/min)10min后比色(415nm)用蒸馏水调零,完毕后求出各组平均数减去空白对照顺序输入制出曲线图。

6.2  试样溶液的制备及测定

固体试样:称样品约0.1,精确至0.0001g,至于100ml容量瓶或150ml的锥行瓶中,加入25mL乙酸缓冲液4.2),一个磁力棒,在磁力搅动器上高速搅拌30分钟(或震荡至植酸酶)完全溶解,摇匀。(可在离心机上以4000r/min离心10min)。取0.1ml上清液加入锥行瓶中(瓶内必须先加入9.9ml的缓冲液),使样液浓度保持在0.35U/mL左右,待反应。

1每称量一个样品需3个试管做平行样,再加3个做空白。

2建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样,便于检验整个操作过程是否有偏差。

6.3  反应

3:反应步骤及试剂、溶液用量见下:

反应顺序

样品、标准

样品空白(标准空白)

1、加乙酸缓冲液(4.1

0.9mL

0.9ml

2、加入待反应液(植酸酶液)

0.1mL

0.1mL

3、混合(摇匀)

4、依次加入底物(4.3

2mL(植酸钠)

2mL(终止液)

5、混合(摇匀)

637℃水解30min

7、依次加入终止液(4.7

2mL(终止液)

2mL(植酸钠)

8、混合(摇匀)

总体积

5mL

5mL

6.4        样品测定

反应后的试样在室温下静置10min,在离心机上以4000r/min离心10min,用蒸馏水当空白调零,在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值,A(平均数)—A0平均数)为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。

 

7 结果计算和表示

   植酸酶活性U按下式计算:

                             C

                                     U  = ──────────  × F2500

                       m × 30 × 0.1

   式中:U  ── 试样中植酸酶的活性,U/g

         C  ── 根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的Y值,

                                    即:[A(平均数)—A0平均数)]×2.839+0.0188

                                    A:样品溶液的吸光值;     A0:空白的吸光值;

         F  ── 试样溶液反应前的总稀释倍数2500倍;

         m ── 试样质量,g

         30 ── 反应时间,30min

        0.1 ── 0.1ml稀释酶液。

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